Julie Gayet naît d’une mère antiquaire et d’un père, Brice Gayet, professeur de chirurgie digestive à l’Institut mutualiste Montsouris. Son grand-père, Alain Gayet, est chirurgien et Compagnon de la Libération. Elle étudie le chant lyrique dès l'âge de huit ans. Elle s'oriente vers la comédie à 14 ans. À 17 ans, elle part étudier à Londres pour un stage avec Jack Waltzer à l’Actors Studio. Elle étudie ensuite au théâtre-école Tania Balachova, à l’école du cirque Fratellini et étudie le chant lyrique de Tosca Marmor. Elle étudie aussi l’histoire de l’art, la psychologie et le cinéma à l’Université de Paris 3-Sorbonne nouvelle.

En 1993, elle débute comme figurante dans Trois couleurs : Bleu. En 1994, elle joue son premier grand rôle dans Les Cent et Une Nuits de Simon Cinéma d'Agnès Varda.

Elle est également productrice de cinéma et crée trois sociétés : Rouge International en 2007, Amarante International en avril 2012 puis Cinémaphore en juillet 2013, associée au producteur Charles Gillibert (49% des parts chacun, François Pinault détenant 2% du capital de la société).